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免疫組化IHC常見問題點擊次數(shù):1709 更新時間:2021-08-16

IHC信號微弱/無信號
問題解決方案
抗體效力a. 抗體效價不高。可通過增加抗體使用濃度,延長抗體孵育時間進行調(diào)整。
b. 
所用抗體不適用于IHC實驗。建議在非變性WB上測試該抗體,以確保抗體識別非變性抗原,或是選用通過IHC實驗驗證的抗體。
c. 
一抗二抗不匹配。使用針對一抗物種來源的二抗,如一抗宿主為rabbit,則須使用anti-rabbit的二抗。
d. 
抗體失活。避免將標記熒光基團的二抗放置于光照環(huán)境。
酶底物失活或呈色時波長設(shè)置錯誤a. 顯色溶液失去作用,可能是由于底物緩沖液中含有酶抑制劑,或底物緩沖液的pH值不適當。建議取一滴二抗標記酶與底物溶液反應(yīng)可確認顯色溶液是否失去活性。
b. 
錯誤的激發(fā)波長。呈色前確保激發(fā)波長與使用的熒光基團相匹配。
樣品制備問題a. 脫蠟作用不足。建議延長脫蠟時間,使用新鮮配制的二甲苯。
b. 
固定液(福爾馬林或 PFA) 可能改變表位。建議利用抗原修復(fù)方式使表位暴露出來或縮短固定作用的時間。
c. 
固定作用不適當。避免延遲固定或過度固定,一般建議至少固定6小時以上,18~24小時已可滿足大多數(shù)實驗應(yīng)用。
d. 
冰凍切片樣品保存期過長。冰凍切片制備完成后,最好于1-2個月內(nèi)用完,超過6個月的話,建議制備新的玻片。
e. 
熒光染色樣品保存不當。熒光基團在光線下暴露時間過長,可能會導(dǎo)致信號減弱,建議在避光環(huán)境下進行實驗和保存樣品,也可使用防熒光淬滅的封片劑封固樣本。
樣品屬性a. 靶蛋白含量低。建議設(shè)置為陽性対照組,增加抗體使用量或利用放大步驟來放大信號。
b. 
靶蛋白為核蛋白而抗體不能穿透細胞核。建議在封閉溶液與抗體稀釋液中加入滲透試劑,以促進抗體滲透到細胞內(nèi)。
c. 
靶蛋白為膜蛋白而表位可能因為滲透作用被破壞或移除。建議將緩沖液中的滲透試劑減少或移除。
d. 
較厚的組織。如斑馬魚全胚胎或染色建議做細胞破膜,以便抗體順利進入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。
關(guān)鍵步驟:在每次的實驗中,設(shè)置陽性與陰性對照組,以確認是該次實驗的抗體、試劑、組織切片、實驗過程的問題,還是靶蛋白自身表達量低的問題。
IHC非特異性染色/背景值比較高
問題解決方案
固定方式或組織自身可能存在自發(fā)熒光a. 嘗試用非醛類替代醛類。
b. 
用淬滅自發(fā)熒光的染料或方法處理組織樣品:如硼氫化na、短波長的UV照射、蘇丹黑等。
c. 
將石蠟包埋樣品的方法換成冰凍切片(OCT或明膠),減少固定液的影響。
d. 
選擇不會與自發(fā)熒光競爭的熒光染料。福爾馬林、PFA或戊二醛等會產(chǎn)生高背景的熒光,尤其在使用綠色、藍色和紅色波長光譜范圍時;組織中的紅細胞或膠原蛋白等組分會產(chǎn)生很強的自發(fā)熒光,尤其是使用綠色和紅色通道的熒光檢測時。
e. 
組織沖洗不*,有固定液殘留。
f. 
使用福爾馬林或PFA固定過久。一般建議至少固定6小時以上,18~24小時已可滿足大多數(shù)實驗應(yīng)用,注意:如固定時間到了無法繼續(xù)后續(xù)脫水、包埋程序,一定要將組織置換到PBS保存,切勿一直泡于固定液中,否則有可能造成蛋白交聯(lián)無法修復(fù)。
g. 
配置新鮮的固定液
封閉、洗脫或顯色問題a. 增加封閉液濃度、延長封閉時間。
b. 
更換封閉液成分,注意封閉液成分不可與一抗物種同來源,最好與二抗物種同源,如二抗來自馬血清,使用馬血清可得到較干凈的背景。
c. 
底物過量:縮短底物孵育時間。
d. 
信號過度放大:縮短信號放大試劑孵育時間。
e. 
洗脫液不適合:如果原本是用PBS,可更換使用TBS
抗體濃度太高或非特異性結(jié)合a. 降低抗體濃度,如1100調(diào)整為11000
b. 
縮短抗體孵育時間,并在4°c 孵育。
c. 
增加封閉緩沖液濃度。
d. 
做多個目標蛋白染色時,建議使用預(yù)吸附二抗減少與其他物種一抗的交互作用。
e. 
針對二抗與組織發(fā)生非特異性結(jié)合的情況建議每次實驗都要設(shè)置一組不加一抗,只加二抗的對照組,才能確認信號是來自高背景值還是真實信號。
內(nèi)源性酶(過氧化氫酶或堿性磷酸酶)a. 使用酶抑制劑。
過氧化物酶:使用H2O2 (0.3% v/v)
堿性磷酸酶:使用 Levamisol (2 mM)
內(nèi)源性生物素 Avidin 孵育以封閉生物素
組織問題a. 脫蠟不*,可能導(dǎo)致細胞核染色在呈相時模糊,亦可能導(dǎo)致抗體無法辨認抗原或者高背景值。
b. 
抗原修復(fù)方式不適合,建議更換修復(fù)溶液成分或方法。
c. 
一抗與組織物種同源。較常發(fā)生在使用鼠源抗體染鼠源組織時,除了避開同樣物種來源的一抗和組織之外,也可以使用 Mouse-on-Mouse IHC染色試劑盒 (GTX83396) 迸行實驗。
d. 
任何時候都不要讓組織干掉。


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