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間接免疫熒光法-檢測細胞內抗原點擊次數:4878 更新時間:2012-01-12

                                    間接免疫熒光法-檢測細胞內抗原

       細胞內抗原的檢測過程與細胞表面抗原檢測過程基本一致,只是在與一抗孵育前,需要預先對細胞用非離子去污劑進行透化處理。www.biomart.cn/runwell/index.htm

操作方法www.95528igw.cn
1. 取已固定好的細胞爬片或甩片或經過預處理的組織切片(石蠟或冰凍切片);
2. 用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的細胞2min(室溫),有些標本可能需要長達15min,時間視抗原而定;
3. 余下步驟接上述“細胞表面抗原的檢測-間接免疫熒光法”步驟(2);
 
注意事項
1. 在使用前,一抗二抗均應測試其合適的稀釋度。
2. 多聚甲醛的固定是不穩定的,標本經多聚甲醛固定后,應再用去污劑處理,如果標本在水溶液中浸泡的時間過長,則會使交聯結構解體。因此,應避免固定后的標本在水溶液中浸泡的時間過長。
3. 信號微弱的解決方法:
① 提高一抗和二抗的濃度以增強敏感性 ,這必須測試各種濃度抗體的滴度;
② 延長一抗和二抗的孵育時間。由于細胞染色時抗原吸附在固相載體上,抗原抗體結合時間較在溶液中長。孵育時間可因實驗設計作適當調整,但少于20min抗體和抗原幾乎不能有效結合。在以上兩點中,應摸索出一個*條件以產生有效信號且保持良好的背景。這就需要反復試驗,因為每組抗體和抗原的情況會有所不同;
③ 改變檢測方法,用共聚焦顯微鏡觀察,可提高敏感性。
4. 背景不好的解決方法
細胞樣本進行熒光染色時,背景問題主要來自兩個方面,即非特異性染色和特異性交叉反應。
① 非特異性吸附:非特異性吸附背景問題的產生與抗原抗體的特異性結合無關。即一抗或二抗與樣品相互作用而發生吸附,而不是與抗原發生特異性結合。
*將所有抗體溶液或含蛋白的檢測試劑用100,000′g離心30min以去除蛋白聚合物。
*滴定一抗和所用的檢測試劑,以確定能夠產生合適信號的zui低濃度。
*固定后,用飽和量并不被檢測試劑結合的非特異性抗體封閉樣品,有效的封閉液包括5%的與標記二抗來源相同的同種血清、3%的BSA和3%的脫脂奶粉。
*用上述封閉液稀釋抗體和檢測試劑。
*固定后,在所有的緩沖液及洗滌液中加入2%吐溫-20。
*縮短一抗或標記試劑的孵育時間。
*充分洗滌(延長洗滌時間,重復次數)。
*改變檢測方法。
② 特異性背景:造成特異性背景問題的原因有三種因素,即污染抗體所致假陽性、交叉反應和樣品中含有能與Ig結合的蛋白質。
*如用多克隆抗體,應滴定抗體(假陽性)。
*如用多克隆抗體,親和純化特異性抗體(假陽性)。
*如用多克隆抗體,用適當的丙酮肝臟粉吸收以阻抑假陽性。
*換用其他抗體(交叉反應及假陽性)。www.95528igw.cn
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