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PCR疑難解決辦法總結點擊次數:3885 更新時間:2012-03-15

                                  PCR疑難解決辦法總結

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問題1:不出現擴增條帶引物:引物質量是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。對策為:選定合適的引物合成單位;引物的濃度不僅要看OD值,用引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應與引物合成單位協商解決,如一條引物亮度高,一條引物亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度;引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏而導致變質降解失效;引物設計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,濃度過高可降低擴增的特異性,濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。靶序列變異:如靶序列發生突變或缺失,影響引物與模板特異性結合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會成功的。
問題2:出現非特異性擴增帶 PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶出現的原因:一是引物與靶序列不*互補,或引物聚合形成二聚體;二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量,往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現,酶量過多有時也會出現非特異性擴增。對策為:必要時重新設計引物;減低酶量或調換另一來源的酶;降低引物量,適當增加模板量,減少循環次數;適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93變性,65左右退火與延伸
問題3:出現片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。可能由于Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多,GC含量過高引起。對策為:適當降低Mg2+濃度;增加模板量;減少循環次數;加入添加劑甘油或Qiagen公司的Q-solution
問題4:污染的監測——對照試驗 1.陽性對照:應設有陽性對照,它是PCR反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好,經各種鑒定是該產物的標本,如以重組質粒為陽性對照,其含量宜低不宜高(100個拷貝以下 2.陰性對照:每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照,被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照;試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNARNA進行PCR擴增,以監測試劑是否污染。 3.重復性試驗 4.選擇不同區域的引物進行PCR擴增
問題5:污染的處理(一)環境污染 1.稀酸處理法 2.紫外照射(UV)(二)反應液污染,可采用下列方法之一處理: 1DNase I 2.內切酶法 3.紫外照射法 4Gama射線輻射法(三)尿嘧啶糖苷酶(UNG)由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好,而臨床用于檢測的PCR擴增片段通常為300bp左右,因此UNG的預防作用日益受到重視和肯定。(四)固相捕獲法用于去除標本中污染的核酸和雜質。(五)RS-PCR(RNA-specificPCR) 也稱為鏈特異性PCR,主要指用于RNA模板的特異性PCR法,該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。(六)抗污染引物法該對引物擴增時通過病毒DNA克隆如入質粒的位點,這一區域只存在于完整的原病毒中。如果重組質粒污染了標本,就不能擴增出任何條帶,即使出現了擴增帶,其大小也與預期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴增,因此只要出現預期大小的擴增帶就可以證明標本是陽性的,該法試用于環狀靶分子系列。
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