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蛋白質色譜的化技術點擊次數:4266 更新時間:2012-04-10

                                                          蛋白質色譜的化技術

摘自<生物產業技術>

蛋白質色譜的化是應對當前細胞培養產能提升和政府監管力度加大的重要手段之一。本文從蛋白質色譜介質的創新、色譜過程的集成和強化等方面介紹了蛋白質色譜化的主要途徑和研究進展,從而為蛋白質色譜化技術研究和分離純化工藝的設計、開發提供借鑒。
 
1. 蛋白質色譜介質的創新-新型色譜介質的合成
1.1 雙孔與超大孔色譜介質
色譜介質是蛋白質色譜的核心構件。目前商業化蛋白質色譜介質的孔道尺寸多在100 nm以下,孔道對蛋白質分子的(擴散)傳質存在嚴重地阻滯作用,導致色譜柱效、處理能力(動態吸附容量)和分離度的顯著降低。上世紀80年代后,若干研究相繼報道了利用孔內對流傳質改善色譜介質孔內傳質的實驗結果。基于這一思路,1990年前后Afeyan等人合成了聚苯乙烯-二乙烯基苯POROS®介質[1]。POROS®介質同時具有600-800nm的對流孔以及連接這些對流孔、孔徑在50-150nm的擴散孔。POROS®介質內蛋白質分子通過對流傳質而迅速到達色譜配基附近;而連接對流孔間的擴散孔在縮短擴散距離(<1 μm)的同時也提供了較大的比表面積,從而確保了色譜介質的高吸附容量。受此啟發,一系列基于不同材料和合成方法的大孔、超大孔蛋白質色譜介質相繼問世。天津大學孫彥等人分別以碳酸鈣顆粒和水為致孔劑合成了具備超大孔結構的瓊脂糖、纖維素以及聚甲基丙烯酸環氧丙酯(GMA)-甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)等色譜介質[3]。蛋白質分子在超大孔瓊脂糖離子交換色譜介質內的有效擴散系數為傳統瓊脂糖色譜介質的2倍以上,動態吸附容量提高了50%并且在300-1800 cm/h的線性速度范圍內柱效基本恒定[4]
1.2 微濾膜和整體柱
另一種引入微米級孔道結構的方法是以微濾膜為色譜介質。這種以微濾膜為色譜介質的色譜分離方法稱為膜色譜。微濾膜的孔徑通常在0.22μm以上,在跨膜壓差作用下料液中的蛋白質分子以主體流動的方式流經微濾膜,接近膜孔表面的色譜配基。因此,膜色譜可以實現高流速下目標蛋白質的快速分離。由于微濾膜內無擴散孔且膜厚度有限(100-200 μm),膜色譜的處理能力和柱效通常很低,因此更多地應用于親和色譜中。
整體柱技術是解決上述瓶頸的有效方法。整體柱的色譜介質是在色譜柱內通過原位聚合方法合成的柱狀多孔固定相,其可看作是若干疊加的微濾膜。與超大孔色譜介質粒子類似,整體柱內同時具備微米級的對流孔和納米級的擴散孔[5]。與膜色譜相比,整體柱內擴散孔提供了更大的吸附面積,解決了膜色譜處理能力低的問題。與填充超大孔粒子的常規固定床色譜相比,整體柱的制備方法更便捷、重現性更好;整體柱的空隙率幾可忽略不計(填充床色譜柱通常在0.3-0.5之間),處理能力得以顯著提升;流經整體柱的流動相均以主體流動方式穿過對流孔,傳質速率更快。
在此基礎上,孫彥等人構想了一個整體柱色譜的理想結構模型,如圖1所示[3]。整體柱的對流孔由內徑1-5μm、緊密排布且平行于色譜柱軸向的六角直管構成;六角直管管壁的多孔骨架(圖1中灰色部分)則形成整體柱的擴散孔,其厚度為1-5μm。色譜過程中,流動相可徑直流經色譜柱,有效地降低了流動相的流動阻力。構成擴散孔的多孔骨架一方面縮短了蛋白質分子孔內擴散距離,實現了蛋白質分子與吸附位點的快速結合;另一方面,多孔骨架提供了更大的吸附面積,提高了吸附容量。因此,整體柱在滿足流動相高傳質速率的同時,確保了蛋白的高吸附容量。但該方法的實現還需要在材料、合成工藝方面的進一步創新。
 
圖1 理想色譜介質的結構示意圖[3]
1.3 葡聚糖接枝離子交換色譜介質
近來,一種以Sepharose XL系列介質為代表的離子交換色譜介質引起了廣泛關注。這類介質是通過將葡聚糖接枝于常規色譜介質的孔道表面,進而偶聯離子交換配基的方法得到的。Stone等人的研究表明,接枝分子量為40kDa葡聚糖的Sepharose 6B色譜介質的孔徑由19.4 nm降低到6.1 nm;但在葡聚糖接枝的離子交換色譜介質內,溶菌酶的有效擴散系數卻可達其在自由溶液中的5-10倍[6];同時,蛋白質的飽和吸附量也有明顯提高[7]
蛋白質色譜的處理能力不僅取決于傳質速率也與介質的飽和吸附量有關。受限于蛋白質在水溶液中的溶解度,蛋白質在色譜介質上的吸附容量往往低于500 mg/mL[8]。在有限的吸附容量條件下,選擇性吸附目標蛋白成為今后蛋白質色譜發展的一個重要方向。這方面的研究工作已經有了一些非常有益的嘗試[3]
2. 蛋白質色譜的過程集成-膨脹床色譜
2.1 膨脹床色譜的方法和優勢
細胞培養的粗料液中不僅含有目標蛋白還包括大量共存的可溶性(如雜蛋白、核酸等)及不可溶性雜質(如細胞碎片等),因此需要引入額外的單元操作來處理共存的雜質。這勢必導致目標蛋白收率的降低。在生物分離過程中,多個單元操作的過程集成是解決這一問題的有效途徑之一。
膨脹床色譜就是這樣的一種將細胞(碎片)分離、蛋白吸附和目標蛋白回收等步驟集成的色譜分離技術。膨脹床色譜柱的頂部和底部分別安裝有可調節高度的高度調節器和可自由通過細胞碎片的流體分布器。色譜柱內填充的具有一定粒徑和密度分布的色譜介質;當流動相自柱底高速流入時,色譜介質在流動相的作用下流態化,沿色譜柱軸向形成穩定的粒徑和(或)密度分布,床層的空隙率大為提高(可到0.8以上),粗料液中的細胞或細胞碎片等固體雜質可自由通過。膨脹床色譜可認為是一種穩定的流化床模式;與常規流化床相比,膨脹床色譜中流動相以近平推流的方式流經色譜柱,固、液兩相返混程度較低,近似于固定床色譜。因此,膨脹床色譜技術適用于從含有固形雜質的粗料液中回收目標產物。
2.2 膨脹床色譜介質及分級特性
膨脹床色譜成功的關鍵在于開發的色譜介質。表1列出了若干商品化膨脹床色譜介質的特性參數。為了適應膨脹床色譜高流速操作的需要,理想的膨脹床色譜介質應當具有較高的密度和較短的介質內傳質路徑,高密度小粒徑色譜介質和薄殼型色譜介質成為了膨脹床色譜介質的發展方向。孫彥等人先后開發了多種瓊脂糖包裹高密度惰性材料(如氧化鋯-硅膠、玻璃珠等)的高密度薄殼型膨脹床色譜介質[3]。在相同的操作條件下,瓊脂糖包裹玻璃珠的薄殼型色素親和色譜介質的動態吸附容量可達商業化膨脹床色譜介質的2倍以上[9]
表1 商品化的膨脹床色譜介質及主要特性(Spherodex,預裝柱,瓊脂糖凝膠,美國GE
名稱
材料
粒徑分布
(μm)
介質密度
(g/mL)
Streamline 系列介質
瓊脂糖包埋微米級石英砂顆粒
100-300
~1.2
Rhobust Fastline介質
瓊脂糖包埋碳化鎢顆粒
20-200
3.0 (2.5-3.5)
Spherodex系列介質
Spherosil LS系列介質
Agarose-ZS[3]
AG-S[3]
AG-L[3]
硅膠表面偶聯葡聚糖
硅膠表面偶聯硅烷醇
瓊脂糖包裹氧化鋯-硅膠顆粒
小玻璃珠/4%瓊脂糖薄層
大玻璃珠/4%瓊脂糖薄層
100-300
~190
~136
70-190
130-280
1.34
2.39
1.77
1.98

 

填充于色譜柱中的膨脹床色譜介質在流動相流速的作用下沿色譜柱軸向方向形成穩定的粒徑和密度分布。這種分布取決于由Stokes沉降速率方程確定的色譜介質的終端速度,其中終端速度大的色譜介質主要分布于色譜柱底部,終端速度小的色譜介質分布于色譜柱頂部。孫彥等人研究結果表明,6%瓊脂糖包埋石英砂顆粒的Streamline介質在膨脹床色譜軸向存在著明顯的粒徑分布(80-500 μm)而無密度分布;由此相反,6%瓊脂糖包裹不銹鋼微球的6AS介質則沿色譜柱軸向呈現顯著的密度分布[10]。色譜介質沿膨脹床色譜軸向的這種粒徑或密度分布可與柱內采樣高度(h)很好地關聯。周鑫等人對瓊脂糖包裹不同粒徑玻璃珠的薄殼型色譜介質的分級規律研究結果進一步顯示,膨脹床色譜內介質的軸向密度分布隨著介質密度的增大而越加顯著;當介質密度很大時,介質沿軸向呈現明顯的密度分布,粒徑分布則可忽略[11]。周鑫等人提出了如下的經驗方程關聯介質在膨脹床內的粒徑和密度分布[11]
(1)
其中,S為,
(2)
在膨脹床色譜過程中,固相介質的分級特性還受到溶液組成、性質等因素的影響。楊征和孫彥發現,當流動相的粘度由低變高時,膨脹床色譜柱底的空隙率持續增大;而色譜柱中部和上部的空隙率則由于底部介質向上的擠壓作用而呈現先降后升的規律[12]Fenandez-Lahore等人發現,處理含有細胞的粗料液過程中,膨脹床的空隙率必須超過80%以確保操作的穩定性[13]
2.3 膨脹床色譜的應用
膨脹床色譜已成功地應用于不同蛋白質的分離純化過程。Clemmitt和Chase利用Streamline Chelating介質從大腸桿菌細胞勻漿液中直接提取了含有組氨酸標簽的谷胱甘肽轉移酶,收率達到80%以上 [14]。同時,膨脹床色譜也受到了產業界的關注。DSM生物技術公司的Doeven和Boer利用裝填MabDirect Protein A的膨脹床色譜柱直接從CHO細胞培養液(50L)中捕集單抗,單抗的收率和純度均不低于現有工藝[15]
3. 蛋白質色譜的過程強化-電色譜技術
電色譜是一種在外加電場作用下的液相色譜分離技術。在電色譜過程中,流動相在電滲流、壓力流的推動下流經色譜柱,其間荷電溶質的傳質源自主體流動、電泳和電滲流等的共同作用。上世紀五、六十年代,研究人員開始嘗試將電場引入到色譜分離過程中并報道了分離血清蛋白的成功案例[16]。在電色譜過程中,液相主體流動的推動力來自壓力和電滲作用;溶質在色譜介質內的輸送則通過擴散傳質和電動傳質完成。現有的實驗和理論分析結果顯示,外加電場可誘導色譜介質內液相發生主體流動。這與此前介紹的蛋白質在對流孔內的傳質行為異曲同工,可顯著提高蛋白質在孔內傳質速率,進而提高色譜柱的柱效。另一方面,由于色譜介質孔道對傳質的阻滯作用和對蛋白分子的空間排阻作用,蛋白質在介質內的傳質速率通常要明顯小于其在主體液相中的傳質速率,由此導致蛋白分子在色譜介質表面的“累積”,形成濃差極化(concentration polarization)現象。濃差極化現象為電色譜過程中的蛋白質分子提供了一個新的保留機理。
色譜過程中的電場主要是通過軸向電場和橫向交變電場兩種方式引入的。目前報道的多數制備型電色譜是通過外加軸向電場的方式實現的,其中電場強度方向與流動相的流動方向平行。在軸向電場作用下的電色譜中,外加電壓與色譜柱高成正比,因此色譜放大過程中色譜柱高的加長會導致外加電壓的升高和操作成本的增加。另外,高電壓的應用也會產生大量的焦耳熱和電解氣,由此帶來色譜柱散熱困難和電解氣的“累積”,影響到電色譜操作的穩定性。為了解決上述問題,孫彥等人提出了橫向交變電場的電色譜技術 [17],即色譜過程中電場強度的方向垂直于流動相的流動方向。帶有橫向交變電場的電色譜柱由位于中間的凝膠室及其兩側的電解液室構成,凝膠室與電解室之間采用裝填25%聚丙烯酰胺凝膠的多孔陶瓷板隔開。這種新型電色譜柱設計縮短了電極的距離,從而確保了用較低電壓獲得所需的電場強度。孫彥等人將此電色譜成功地應用于凝膠過濾色譜、離子交換色譜和親和色譜分離蛋白質的過程中。賈國棟等人對比了不同的電場引入方式對電色譜性能的影響[18]。結果如表2所示。從中可以看出,在外電場的作用下,色譜的處理能力(用δ50表示)要明顯高于無外加電場的常規色譜。
2 不同外電場模式下色譜處理能力(δ50值)的比較
電場
橫向交變電場
軸向電場
二維電場
60mA
100mA
10mA
20mA
δ50
2.4
3.8
2.4
NA*
4.5
* 該條件下色譜無法穩定操作www.95528igw.cn
4. 展望
作為生物下游的核心技術之一,蛋白質色譜技術一直受到學界和產業界的廣泛關注并取得了長足的進步。在今后相當長的階段,蛋白質色譜技術的創新、過程的優化和理論的完善仍將是蛋白質色譜發展的主要方向。同時,蛋白質分子界面現象的準確描述和蛋白質吸附機理的正確闡述也將為蛋白質色譜技術的化提供科學的指導。因此,可以預見未來蛋白質色譜技術的研究將是由多種先進的實驗技術和研究手段支撐的、在多個尺度上共同開展并相互關聯的理論和實踐工作。這將為生物技術產業的發展提供強有力的支撐。
 
符號說明
a 方程(1)中的常數,無因次;
b 方程(1)中的常數,無因次;
D 采樣高度處的平均粒徑,μm;
D0 色譜介質的平均粒徑,μm;
h 柱內采樣高度,m;
H 膨脹狀態下床層的高度,m;
S 方程(2)確定的參數,無因次;
ρ 采樣高度處介質的平均密度,g/mL;
ρ0 色譜介質的平均密度,g/mL;
ρL 流動相溶液的密度,g/mL;
δ50 電場作用下色譜的動態吸附容量與常規色譜的動態吸附容量之比,無因次

 

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