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細胞培養常見問題點擊次數:1616 更新時間:2016-04-21

細胞培養常見問題

 1.冷凍管應如何解凍?
  
  取出冷凍管后,須立即放入37°C水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化,并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,必須注意安全,預防冷凍管之爆裂。
  
  2.細胞冷凍管解凍培養時,是否應馬上去除DMSO?
  
  除少數特別注明對DMSO敏感之細胞外,絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞),在解凍之后,應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中,待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO即可,如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。
  
  3.可否使用與原先培養條件不同之培養基?
  
  不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基,若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基,細胞大都無法立即適應,造成細胞無法存活。
  
  4.可否使用與原先培養條件不同之血清種類?
  
不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源,所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。
  
  5.何謂FBS,FCS,CS,HS?
   FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思,兩者都是指胎牛血清,FCS乃錯誤的使用字眼,請不要再使用。CS(calfserum)則是指小牛血清。HS(horseserum)則是指馬血清。
  
  6.培養細胞時應使用5%或10%CO2?或根本沒有影響?
  
   一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統,而培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的CO2濃度。當培養基中 NaHCO3含量為每公升3.7g時,細胞培養時應使用10%CO2;當培養基中NaHCO3為每公升1.5g時,則應使用5%CO2培養細胞。
  
  7.何時須更換培養基?
  
  視細胞生長密度而定,或遵照細胞株基本數據上之更換時間,按時更換培養基即可。
  
  8.培養基中是否須添加抗生素?除于特殊篩選系統中外,一般正常培養狀態下,培養基中不應添加任何抗生素。
  
  9.附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA濃度?應如何處理?
  
  一般使用之trypsin-EDTA濃度為0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于–20°C,避免反復冷凍解凍造成trypsin之活性降低,并可減少污染之機會。
  
  10.懸浮性細胞應如何繼代處理?
  
  一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中,稀釋細胞濃度即可,若培養液太多時,可將培養角瓶口端稍微抬高,直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶,加入新鮮培養基稀釋至適當濃度,重復前述步驟即可。
  
  11.欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?
  
  欲回收動物細胞,其離心速率一般為300xg(約1,000rpm),5-10分鐘,過高之轉速,將造成細胞死亡。
  
  12.細胞之接種密度為何?依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。
  
  13.細胞冷凍培養基之成份為何?
  
  動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO稀釋時會放出大量熱能,故不可將DMSO直接加入細胞液中,必須使用前先行配制完成。
  
  14.DMSO之等級和無菌過濾之方式為何?
  
   冷凍保存使用之DMSO等級,必須為Tissueculturegrade之DMSO(如SigmaD2650),其本身即為無菌狀況,次開瓶后應立即 少量分裝于無菌試管中,保存于4°C,避免反復冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質,并可減少污染之機會。若要過濾DMSO,則須使用耐DMSO之 Nylon材質濾膜。
  
  15.冷凍保存細胞之方法?
  

  冷凍保存方法一:冷凍管置于4°C30~60分鐘→(-20°C30分鐘*)→-80°C16~18小時(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。
  

  冷凍保存方法二:冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3°C至–80°C以下,再放入液氮槽vaporphase長期儲存。*-20°C不可超過1小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
  
  16.細胞欲冷凍保存時,細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?
  
  冷凍管內細胞數目一般為1x106cells/mlvial,融合瘤細胞則以5x106cells/mlvial為宜。
  
  17.應如何避免細胞污染?細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之方法。
  
  18.如果細胞發生微生物污染時,應如何處理?
  
  直接滅菌后丟棄之。
  
  19.支原體(mycoplasma)污染的細胞,是否能以肉眼觀察出異狀?
  
  不能。除極有經驗之專家外,大多數遭受支原體污染的細胞株,
  
  無法以其外觀分辨之。
  
  20.支原體污染會對細胞培養有何影響?
  
  支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數,代謝及研究之任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結果之數據方有意義。
  
  21.偵測出細胞株有支原體污染時,該如何處理?
  
  直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。
  
  22.CO2培養箱之水盤如何保持清潔?
  
  定期(至少每兩周一次)以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
  
  23.為何培養基保存于4°C冰箱中,顏色會偏暗紅色,且pH值會越來越偏堿性?
  
  培養基保存于4°C冰箱中,培養基內之CO2會逐漸溢出,造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenolred)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果,將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時,可以通入無菌過濾之CO2,以調整pH值。
  
  24.各種細胞培養用的dish,flask是否均相同?
  
  不同廠牌的dish或flask,其所coating的polymer不同,制造程序亦不同,雖對大部分細胞沒有太大之影響,惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長差異。
  
  25.購買之細胞冷凍管經解凍后,為何會發生細胞數目太少之情形?
  
  研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少,大都是因為離心過程操作上的失誤,造成細胞的物理性損傷,以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心,應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。
  
  26.購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因?
  
  研究人員在細胞培養時出現存活率不佳,常見原因可歸納為:培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后,加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80°C太久。
  
  27.收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因?
  
  冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時,均應立刻將冷凍管再一次扭緊.

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